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ELISA試劑盒常見問題及預防措施

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是指將可溶性的抗原或抗體結合到固相載體上,利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。

但在實際操作及分析中,總會出現(xiàn)各種問題,本次就ELISA常見問題分析匯總,希望對科研君的實驗有所幫助。

問題1:高背景/非特異性顯色

結果描述 可能的原因 建議或預防措施
終止后,整板結果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色;或標曲有線性但背景過高 整板發(fā)黃現(xiàn)象可能是錯加其他試劑造成 實驗前檢查試劑的組份及批號,確認所有組份均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。
未充分清洗酶標板 確保清洗過程中每個微孔所加入洗滌液量一致。清洗完成后,將酶標板倒扣在吸水紙上輕拍幾下,以除去殘余的緩沖液。
孵育時間過長 嚴格按照說明書操作。
酶標記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器,或陽性對照污染了微孔 吸取不同的試劑時應更換吸頭,配置不同的試劑組份時,應使用不同的儲液器皿。操作時請使用移液器。
檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高 檢查濃度計算是否正確或進一步稀釋后再使用。
底物在使用前曝光或污染 加入底物前,應始終避光保存。
顯色時間過長 嚴格按照說明書顯色時間操作。
讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片 TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值,并以540nm或570nm作為校正波長。

問題2:白板

結果描述 可能的原因 建議或預防措施
顯色步驟結束后,酶標板所有孔均無顏色;陽性對照不顯色 組份試劑混淆使用 配制或使用時應看清楚標簽。
洗板及加樣過程中,酶標物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 確認配制洗液的容器已洗干凈、無污染。
遺漏了某種試劑或某個步驟 詳細審閱說明書,并嚴格遵循操作步驟。

問題3:顯色淡

結果描述 可能的原因 建議或預防措施
包括標曲、樣本在內的所有板孔顏色均較淡 試劑盒超過有效期或儲存不當 請在有效期內使用,并按照說明書推薦的保存條件保存,避免污染。
試劑、樣品用前未平衡 所有試劑、樣品應置室溫平衡30min。
移液器吸量不足,移液抽吸排放太快,吸頭內壁掛液太多或內壁不清潔 校正移液器,吸頭要配套,每次吸頭要吻合緊密。移液不宜過快,排放應完全。吸頭內壁要清潔,最好一次性使用。
孵育反應時間不足 定時器準確定時。
顯色反應時間不足 一般在15-30min,20min為佳,特殊除外。
顯色劑加入順序顛倒(雙組份) 請嚴格按說明書。
洗滌次數(shù)增加,濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求 減少洗滌沖擊力,按說明書要求稀釋濃縮洗液、洗滌時間,準確記錄洗滌次數(shù)及用量。
蒸餾水水質有問題 確保配制試劑所需蒸餾水無污染。
洗板及加樣過程中,酶標物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 確認配制洗液的容器已洗干凈、無污染。
標曲正常,樣本顯色較淡 樣本使用NaN3防腐,抑制了酶的反應 樣本樣本不可使用NaN3。
待測標本中可能不含強陽性標本,故結果可能是正常的 如有懷疑,可復檢。
目測結果正常,但酶標儀讀值偏低 讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片 TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值,并以540nm或570nm作為校正波長。

問題4:標準曲線不佳/重復性不好

結果描述 可能的原因 建議或預防措施
重復性差 標準品配制有誤 嚴格按照說明書標準品配制進行操作。僅使用推薦的稀釋液對標準品進行稀釋。
試劑盒儲存方法不當或儲存環(huán)境太差 請在說明書推薦的保存條件下保存,不要將重懸后的組份在室溫放置時間過長。
過早稀釋各工作組分 各工作組份請在使用前10分鐘配制,并立即加入到微孔中。
樣本加入后未混勻 針對同時加入多種試劑組份,加樣后在混勻器上充分混勻。注意穩(wěn)拿穩(wěn)放,防止外濺。
酶標儀測定重復性差 校準酶標儀。
孵育時間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致 重復測定標本,反應條件、人員等盡可能與上次保持一致。
洗滌不正確 移液器準確吸取所需洗液體積并注入孔內,切勿溢出。洗板機洗板時不應有堵孔,洗滌應充分。
孵育溫度恒溫效果不好 保證溫度恒定,避免局部溫度過高過低。
加液時,過多殘留于孔壁上 加液時,吸頭在不碰到孔底或孔壁的前提下盡量懸空加。
耗材重復使用 吸取不同的試劑時應更換吸頭,配置不同的試劑組份時,應使用不同的儲液器皿。
微孔底部被劃傷或存在污垢 操作時細心,注意不要觸碰底部。擦拭酶標板底部,以去除污垢或指紋。
定性檢測結果判定時,閾值附近時陰時陽 同一樣品做3個復孔,以2個(含2個)以上相同結果為準。
加樣時交叉污染 加樣本時更換槍頭,避免交叉污染。
出現(xiàn)隨機性的花板、跳孔現(xiàn)象 拍板時交叉污染 拍板時用合適的吸水紙巾,不要把無關物質拍進板孔,并盡量不要在同一位置拍,以免交叉污染。
洗板機加液頭堵塞導致加液不滿或吸液殘留量較大,造成花板、跳孔 疏通洗板機加液頭。
樣本離心處理不全,致使反應孔內發(fā)生凝血現(xiàn)象或存在沉淀物或殘留細胞成分干擾 存放的樣本應充分離心。
樣品放置時間過長,污染 樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止污染。
洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液 按說明書配制。