ELISA試劑盒技術(shù)原理及方法對比
1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann，荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) 。
1. ELISA技術(shù)原理
ELISA 是將抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)，利用酶標技術(shù)標記抗原或抗體，通過顯色反應(yīng)，用以檢測相應(yīng)的抗體或抗原，對其進行定性或定量分析。
① 將已知的抗原或抗體通過物理吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；
② 利用酶標技術(shù)使抗原或抗體與酶形成酶結(jié)合物，并保持酶標抗原或抗體的免疫活性及酶的活性；
③ 酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，加入底物，底物被酶催化顯色，依據(jù)底物顏色反應(yīng)及深淺判斷待測物中相應(yīng)抗體或抗原的量。
2. 三種必要的試劑
在這種測定方法中有3種必要的試劑：
① 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）
② 酶標記的抗原或抗體（標記物）
③ 酶作用的底物（顯色劑）
3. ELISA四種常用的方法
ELISA可用于測定抗體,也可用于檢測抗原。根據(jù)檢測目的和操作步驟不同,有四種類型的常用方法：間接法、雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、競爭法。
3.1 間接法（此法是測定抗體最常用的方法）
將已知抗原吸附于固相載體,加入待檢標本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后,加入酶標抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定。
3.2 雙抗體夾心法（此法常用于測定抗原）
將已知抗體吸附于固相載體、加入待檢標本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌,加入酶標抗體和底物進行測定。
3.3 雙抗原夾心法（此法多用于乙肝抗體檢測）
將已知抗原吸附于固相載體、加入待檢標本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。溫育后洗滌,加入酶標抗原和底物進行測定。
3.4 競爭法（此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體）
以測定抗原為例，將持異性抗體吸附于固相載體;加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原,使二者競爭與固相抗體結(jié)合;經(jīng)過洗滌分離,最后結(jié)合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關(guān)。
4. ELISA四種方法的比較
| 方法 | 注意點 | 優(yōu)勢 | 缺點 |
|---|---|---|---|
| 間接法 Indirect ELISA |
關(guān)鍵是抗原的純度。也要注意正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體這一干擾因素。 | 二抗可以加強信號，而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標記的一級抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性。 | 交互反應(yīng)發(fā)生的機率較高。 |
| 雙抗體夾心法Sandwich ELISA | 兩種抗體必須小心選取，才可避免交互反應(yīng)或競爭相同的抗原結(jié)合部位。 | 高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。 | 抗原一定得擁有兩個以上的抗體結(jié)合部位。 |
| 雙抗原夾心法Sandwich ELISA | 關(guān)鍵在于酶標抗原的制備。根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。 | 受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。 | 只適用于某些項目，受抗原大小等很多因素影響。 |
| 競爭法 Competitive ELISA |
這兩種抗體必須小心選取，才可避免交互反應(yīng)或競爭相同的抗原結(jié)合部位。 | 可適用比較不純的樣本，而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。 | 整體的敏感性和專一性都較差。 |
