抗體常見問(wèn)題及解答
Q: 什么是特定的抗體？
抗體（Ab），也被稱為免疫球蛋白（Ig），是一種Y型的蛋白質(zhì)，通過(guò)Fab區(qū)域的可變區(qū)域來(lái)中和病原體，例如致病性細(xì)菌和病毒。
Q: 如何選擇適合我的實(shí)驗(yàn)的正確抗體？CUSABIO是否提供具有多種應(yīng)用的抗體？
您在選擇抗體時(shí)需要注意以下幾個(gè)方面：樣本的物種、抗體的宿主物種、抗體的標(biāo)記方式以及適用于您實(shí)驗(yàn)的推薦稀釋比例。CUSABIO保證其抗體適用于標(biāo)注在網(wǎng)站或產(chǎn)品數(shù)據(jù)表上的應(yīng)用和物種。如果您使用的應(yīng)用我們沒有測(cè)試過(guò)，我們將為您提供試用樣品，在購(gòu)買正裝之前進(jìn)行評(píng)估。
Q: 單克隆抗體和多克隆抗體有什么區(qū)別？
單克隆抗體是使用相同的克隆免疫細(xì)胞制備而成，它們都是來(lái)自一個(gè)特定的母細(xì)胞的克隆。因此，它們對(duì)同一抗原和表位具有親和力。多克隆抗體是使用多個(gè)不同的免疫細(xì)胞制備而成，它們對(duì)同一抗原具有親和力，但結(jié)合的表位不同。單克隆抗體只結(jié)合一個(gè)表位，而多克隆抗體則結(jié)合同一蛋白質(zhì)上的不同表位。單克隆抗體比多克隆抗體更加特異且背景噪音更少，因此在生化分析中通常更可取。然而，單克隆抗體的生產(chǎn)成本通常更高，適應(yīng)性較差，并且對(duì)抗原的微小變化非常敏感。
Q: 一抗和二抗之間有什么關(guān)系？如何選擇適合我實(shí)驗(yàn)的正確二抗？
一般情況下，一抗用于捕獲目標(biāo)蛋白，二抗能夠與一抗結(jié)合，并且標(biāo)記有可以放大檢測(cè)信號(hào)的酶或染料。我們建議您考慮以下幾個(gè)因素：
a. 根據(jù)宿主物種選擇。例如，如果一抗來(lái)自小鼠，那么二抗應(yīng)該是抗小鼠的。
b. 根據(jù)一抗的特性選擇。
c. 根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，例如WB、IHC、ELISA等。
Q: 您能告訴我每個(gè)抗體結(jié)合多少個(gè)生物素嗎？
生物素與抗體的摩爾比為36.6:1。然而，很難準(zhǔn)確說(shuō)出每個(gè)抗體結(jié)合了多少個(gè)生物素，因?yàn)闃?biāo)記是通過(guò)賴氨酸殘基進(jìn)行的，并不清楚有多少個(gè)原始氨基團(tuán)與生物素結(jié)合。平均而言，每個(gè)IgG分子可以結(jié)合3—5個(gè)生物素分子。
Q: 為什么實(shí)際帶狀物的分子量大于理論分子量？
您可以使用CUSABIO的分子量計(jì)算器計(jì)算抗體的分子量。如果測(cè)試結(jié)果與理論分子量之間有很大差異，可能的原因包括：目標(biāo)蛋白存在多個(gè)修飾位點(diǎn)，例如糖基化，或者與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，或者被切割或降解。
Q：為什么我收到的抗體容量少于標(biāo)簽上所標(biāo)示的容量？
在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中，少量的抗體可能會(huì)附著在產(chǎn)品瓶蓋的密封處。如果需要，可以在臺(tái)式離心機(jī)上對(duì)瓶子進(jìn)行短暫離心，以使容器蓋中的液體脫離。
Q: 您能為該抗體推薦同型對(duì)照嗎？
同型對(duì)照用于確認(rèn)一抗結(jié)合的特異性，以排除非特異性Fc受體結(jié)合或其他蛋白質(zhì)相互作用的影響。同型對(duì)照抗體應(yīng)與一抗的宿主物種、同型和標(biāo)記方式相匹配。例如，如果一抗是FITC標(biāo)記的小鼠IgG1，那么您需要選擇一款FITC標(biāo)記的小鼠IgG1同型對(duì)照。大多數(shù)同型對(duì)照抗體是單克隆抗體，多克隆抗體不適用，因?yàn)槎嗫寺】贵w含有多個(gè)IgG亞類。
Q: 用哪種緩沖液來(lái)儲(chǔ)存抗體？
我們使用0.01M PBS緩沖液（pH 7.4）加入50%甘油。
Q: 您可以提供哪種類型的抗體標(biāo)記？
我們目前提供FITC、HRP、生物素等隨機(jī)標(biāo)記在游離的賴氨酸（Lys）氨基上的標(biāo)記。
Q: 為什么有些抗體不再提供？
我們從庫(kù)存中剔除這些抗體，是因?yàn)槲覀冇行碌漠a(chǎn)品替代它們。
Q: 為什么在免疫印跡（Western Blot）中沒有帶狀物？
可能存在的原因有：
a. 抗體不足。一些抗體可能與目標(biāo)蛋白的親和性較差。您應(yīng)該減少抗體的稀釋倍數(shù)（比推薦的起始稀釋度低2-4倍）。同時(shí)，抗體可能已失去活性，您應(yīng)該進(jìn)行點(diǎn)印跡（Dot Blot）實(shí)驗(yàn)。
b. 蛋白質(zhì)不足。您應(yīng)該提高在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。通過(guò)其他方法確認(rèn)蛋白質(zhì)的存在。使用陽(yáng)性對(duì)照（重組蛋白、細(xì)胞系或處理細(xì)胞以表達(dá)感興趣的分析物）。進(jìn)行點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)。
c. 轉(zhuǎn)膜不良。您應(yīng)該用甲醇濕潤(rùn)PVDF/Immobilon-P膜，或者用轉(zhuǎn)膜緩沖液濕潤(rùn)硝酸纖維膜，以確保PVDF膜與凝膠之間有良好接觸。
d. 轉(zhuǎn)膜不完全。您應(yīng)該延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，因?yàn)橐恍┓肿恿枯^大的蛋白質(zhì)可能需要更長(zhǎng)的轉(zhuǎn)膜時(shí)間。
e. 過(guò)度轉(zhuǎn)膜。對(duì)于分子量較小（低于10 kDa）的蛋白質(zhì)，您應(yīng)該減少轉(zhuǎn)膜電壓或時(shí)間。
f. 等電點(diǎn)大于9。您應(yīng)該使用更高pH值的替代緩沖體系，如CAPS（pH 10.5）。
g. 使用了錯(cuò)誤的二抗。您應(yīng)該確認(rèn)一抗的宿主物種和抗體類型，以選擇正確的二抗。
h. 抗體無(wú)效。不要使用過(guò)期的抗體。
i. 存在偶氮二碘苯酚（Sodium azide）污染。確保緩沖液不含偶氮二碘苯酚，因?yàn)樗赡芟鏗RP信號(hào)。
j. 一抗的孵育時(shí)間不足。您應(yīng)該延長(zhǎng)一抗的孵育時(shí)間，最好過(guò)夜孵育在4℃。
Q: 在免疫印跡（Western Blot）中為什么信號(hào)弱？
可能存在的原因有：
a. 蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合較弱。您應(yīng)該盡量減少洗滌次數(shù)。減少抗體溶液中的NaCl濃度，或者在洗滌步驟中使用印跡緩沖液（推薦范圍為0.15 M-0.5 M）。
b. 抗體不足。您應(yīng)該將抗體濃度增加到比推薦的起始濃度高2-4倍。
c. 蛋白質(zhì)不足。您應(yīng)該提高在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。
d. 反應(yīng)偶聯(lián)不活性。您應(yīng)該在管中混合酶和底物。如果顏色不顯現(xiàn)或者顏色較弱，可以制備新的試劑或購(gòu)買新的試劑。嘗試使用ECL。
e. ECL試劑過(guò)弱/過(guò)舊。您應(yīng)該購(gòu)買新的ECL試劑。
f. 脫脂奶可能掩蓋了某些抗原。您應(yīng)該減少阻斷液中脫脂奶的百分比，或者用3%牛血清白蛋白（BSA）代替。
Q: 為什么在免疫印跡（Western Blot）中出現(xiàn)額外的帶狀物？
可能存在的原因有：
a. 主抗體的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該增加主抗體的稀釋倍數(shù)。減少在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。使用單克隆抗體或抗原親和純化的抗體。
b. 二抗的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該進(jìn)行一個(gè)只用二抗的對(duì)照試驗(yàn)（不加主抗體）。如果出現(xiàn)條帶，則選擇其他二抗，使用單克隆抗體或抗原親和純化的抗體。
c. 分析物的降解。您應(yīng)該盡量減少樣品的凍融循環(huán)，存儲(chǔ)前向樣品中添加蛋白酶抑制劑，或制備新鮮樣品。
d. 分析物的聚集。您應(yīng)該增加DTT的用量以確保還原二硫鍵（20-100 mM DTT）。在加載凝膠前，將樣品置于沸水中煮沸5—10分鐘。進(jìn)行短時(shí)間的離心。
e. 試劑的污染。您應(yīng)該檢查緩沖液是否被污染，或者嘗試制備新鮮的試劑。
Q: 在免疫印跡（Western Blot）中為什么會(huì)出現(xiàn)條狀模糊？
可能存在的原因有：
a. 主抗體的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該將單克隆抗體或抗原親和純化的抗體以更低的濃度稀釋在5%牛奶中，或者調(diào)整非脫脂奶粉（2%-5%）或NaCl（0.15-0.5 M）濃度作為主抗體溶液。
b. 二抗的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該進(jìn)行一個(gè)只用二抗的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（不加主抗體）。如果在膜上出現(xiàn)了條帶，則應(yīng)該稀釋該抗體或嘗試其他二抗。
c. 阻斷不足。您應(yīng)該使用含有0.1%—0.5% Tween 20、0.15-0.5 M NaCl和25 mM Tris (pH 7.4）的5%脫脂奶粉溶液進(jìn)行阻斷?？梢匝娱L(zhǎng)阻斷時(shí)間。根據(jù)需要調(diào)整奶粉濃度。在4℃下過(guò)夜阻斷可能會(huì)降低阻斷效果，因?yàn)榈蜏叵孪礈靹┛赡懿黄鹱饔谩?/p>
d. 洗滌不足。您應(yīng)該增加洗滌緩沖液中Tween 20的濃度（0.1%—0.5%），或增加洗滌次數(shù)。
e. 脫脂奶粉中可能含有目標(biāo)抗原或內(nèi)源性生物素，并且與親和素/鏈霉親和素不相容。您應(yīng)該使用3% BSA進(jìn)行替代。
f. 某些IgY抗體可能會(huì)識(shí)別奶蛋白。您應(yīng)該使用3% BSA進(jìn)行替代。
g. 膠片曝光過(guò)度。您應(yīng)該減少曝光時(shí)間。如果目標(biāo)信號(hào)過(guò)強(qiáng)，請(qǐng)多等待5—10分鐘后重新曝光膠片。
Q: 在免疫印跡（Western Blot）中，為什么條帶看起來(lái)模糊且不規(guī)則？
可能存在的原因有：
a. 凝膠不好。在填充之前應(yīng)徹底攪拌溶液。
b. 某些樣品的鹽濃度較高。您應(yīng)該對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽或調(diào)整鹽濃度。
c. 每個(gè)孔中的樣品體積不一致。您應(yīng)該調(diào)整樣品體積，使其基本相同。
d. 緩沖液不起作用。您應(yīng)該購(gòu)買新的緩沖液或制備新的緩沖液。
e. 膜中有氣泡困住。在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中要小心地去除任何氣泡。
f. 電泳過(guò)程中溫度過(guò)高。您應(yīng)該減小電流或電壓。
Q: 在免疫印跡（Western Blot）中，為什么轉(zhuǎn)膜效率低？
可能存在的原因有：
a. pH值接近等電點(diǎn)。您應(yīng)該增加轉(zhuǎn)膜緩沖液的pH值。
b. 膜中有氣泡困住。在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中要小心地去除任何氣泡。
c. 濾紙接觸。濾紙、轉(zhuǎn)膜和凝膠的大小應(yīng)基本相同，以避免濾紙直接接觸。
d. 轉(zhuǎn)膜選擇不當(dāng)。您應(yīng)該使用可靠的PVDF膜或硝酸纖維膜。
e. 電壓或電流過(guò)低。我們建議在濕轉(zhuǎn)膜過(guò)程中使用20 mA的恒定電流，半干轉(zhuǎn)膜時(shí)使用25 V的恒定電壓。
f. 轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短。根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和使用的電泳設(shè)備，選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)膜時(shí)間。
g. 濕轉(zhuǎn)膜過(guò)程中環(huán)境溫度過(guò)高。您應(yīng)該使用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置設(shè)置為4℃。
Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么染色缺失？
可能存在的原因有：
a. 缺乏抗原。我們建議通過(guò)原位雜交檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)，因?yàn)樵谀承┖币娗闆r下，即使已檢測(cè)到mRNA，蛋白質(zhì)的翻譯可能被阻斷。
b. 抗原在與一抗孵育之前被破壞。如果在添加一抗之前進(jìn)行了內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的消除，您應(yīng)該在與一抗孵育后對(duì)過(guò)氧化物酶進(jìn)行阻斷。
c. 抗原恢復(fù)效果不好。您應(yīng)該增加處理時(shí)間或更換處理溶液。
d. 抗體因存儲(chǔ)不當(dāng)而失效。您應(yīng)該按照手冊(cè)上的存儲(chǔ)說(shuō)明操作。通常將抗體分裝成足夠制備單次實(shí)驗(yàn)的小體積，避免反復(fù)凍融。
e. 一抗或二抗失活。您應(yīng)該獨(dú)立測(cè)試報(bào)告系統(tǒng)以評(píng)估試劑的有效性。
f. 一抗和二抗不兼容。您應(yīng)該使用能與一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗是兔源的，則使用抗兔二抗。
g. 組織固定不充分。您可以嘗試增加固定時(shí)間或嘗試不同的固定劑。
h. 組織過(guò)度固定。您應(yīng)該減少浸泡或后固定步驟的時(shí)間。如果無(wú)法避免浸泡固定，可以通過(guò)使用抗原恢復(fù)試劑來(lái)使抗原重新顯露。
i. 抗原在固定或包埋過(guò)程中發(fā)生變化。您可以嘗試通過(guò)各種抗原恢復(fù)技術(shù)來(lái)恢復(fù)免疫反應(yīng)性。
j. 遺漏或錯(cuò)誤使用試劑。您應(yīng)該重復(fù)染色，并確認(rèn)正確使用了正確順序的試劑。
Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么染色結(jié)果不合適？
可能存在的原因有：
a. 固定方法對(duì)抗原不適用。您可以嘗試不同的固定劑或增加固定時(shí)間。
b. 抗原恢復(fù)方法對(duì)該抗原或組織不適用。您可以嘗試不同的抗原恢復(fù)條件。
c. 抗原的靜電荷發(fā)生了變化。您可以嘗試調(diào)整抗體稀釋液的pH值或陽(yáng)離子濃度。
d. 固定延遲導(dǎo)致抗原擴(kuò)散。您應(yīng)該及時(shí)固定組織，并嘗試使用交聯(lián)固定劑而不是有機(jī)（醇）固定劑。
Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么背景較高？
可能存在的原因有：
a. 一抗和/或二抗?jié)舛冗^(guò)高。您應(yīng)該進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)，確定促進(jìn)一抗和二抗特異反應(yīng)所需的最佳濃度。
b. 一抗或二抗與組織的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該在一抗孵育之前進(jìn)行阻斷步驟。非脂乳粉是另一個(gè)選擇。
c. 二抗的非特異性結(jié)合。您應(yīng)該使用去除了交叉反應(yīng)IgG物種的抗體（對(duì)樣本物種進(jìn)行吸附）。
d. 抗體與組織中的蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用。您應(yīng)該降低抗體稀釋液的離子強(qiáng)度。
e. 背景由離子相互作用引起。您應(yīng)該增加稀釋緩沖液的離子強(qiáng)度。
f. 組織變干。在染色過(guò)程中避免組織變干。
g. 試劑附著在老舊或準(zhǔn)備不良的玻片上。您應(yīng)該重新準(zhǔn)備新鮮的或購(gòu)買的玻片。
Q: 在免疫組織化學(xué)染色中，為什么組織或細(xì)胞形態(tài)會(huì)被破壞？
可能存在的原因有：
a. 抗原恢復(fù)方法過(guò)于嚴(yán)酷。您應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定能夠保持組織形態(tài)的條件，同時(shí)恢復(fù)抗原的免疫活性。
b. 組織切片脫落玻片。您應(yīng)該增加固定時(shí)間。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定額外或替代性的固定劑。使用新鮮制備的、電荷充足的玻片。
c. 染色過(guò)程中未完全固定導(dǎo)致物理?yè)p傷組織或細(xì)胞。您應(yīng)該增加固定時(shí)間和/或增加后固定步驟。增加固定劑/組織比例。切割更小的組織塊以進(jìn)行更徹底地浸潤(rùn)固定。
d. 組織自溶導(dǎo)致壞死碎片染色。您應(yīng)該增加固定時(shí)間和比例?？紤]使用交聯(lián)固定劑。
e. 組織切片出現(xiàn)撕裂或折疊。您應(yīng)該在切片下除去氣泡。使用鋒利的刀片重新切割切片，或在分析結(jié)果時(shí)忽略損壞區(qū)域。
f. 組織形態(tài)分辨率差。對(duì)于冰凍切片，應(yīng)該切割更薄的組織切片，因?yàn)楸Э赡芷茐牧私M織形態(tài)。
Q: 在免疫沉淀（IP）中，為什么會(huì)有太多的抗體洗脫？
您應(yīng)該在進(jìn)行免疫沉淀前將抗體與珠子混合，并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫，這樣可以顯著減少抗體的數(shù)量。
Q: 為什么免疫沉淀（IP）中的背景太高？
可能存在的原因有：
a. 抗體與非特異性結(jié)合過(guò)多。您應(yīng)該使用純化的抗體，并減少使用的量。
b. 細(xì)胞過(guò)多/蛋白質(zhì)過(guò)多導(dǎo)致洗脫物中存在大量非特異性蛋白質(zhì)。減少使用的細(xì)胞數(shù)量/裂解液（10-500 µg）。
c. 不能溶解的蛋白質(zhì)殘留。在離心后立即去除上清液。這樣應(yīng)該將不溶性蛋白質(zhì)留在沉淀中。如果重新懸浮發(fā)生，再次離心。
d. 準(zhǔn)備的珠子過(guò)少。您應(yīng)該確保BSA新鮮，并使用足夠的珠子在PBS中含有1%的BSA中孵育1小時(shí)。在使用之前用PBS洗滌3—4次。
e. 洗滌不徹底。您應(yīng)該在相關(guān)階段進(jìn)行充分的洗滌，將蓋子蓋在離心管上，并在離心之前多次倒置。
f. 在免疫沉淀過(guò)程中，抗原降解。您應(yīng)該在裂解之前添加新鮮的蛋白酶抑制劑。
Q: 在染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）中，為什么大區(qū)域顯示低分辨率且背景噪音高？
您應(yīng)該優(yōu)化DNA片段（不超過(guò)1.5 kb）。
Q: 為什么在染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）中樣本中無(wú)法擴(kuò)增DNA？
您應(yīng)該選擇陽(yáng)性對(duì)照模板DNA來(lái)確認(rèn)引物的工作情況。
Q: 在流式細(xì)胞術(shù)（FC）中為什么會(huì)有高背景？
可能存在的原因有：
a. 增益設(shè)置過(guò)高。您應(yīng)該降低增益以減少信號(hào)，并使用陽(yáng)性對(duì)照來(lái)正確設(shè)置流式細(xì)胞儀。
b. 抗體過(guò)多。您應(yīng)該減少抗體濃度。
Q: 為什么在流式細(xì)胞術(shù)（FC）中觀察到兩個(gè)或更多的細(xì)胞群體？
可能存在的原因有：
a. 存在多個(gè)細(xì)胞群體表達(dá)目標(biāo)蛋白。您應(yīng)該檢查細(xì)胞分離是否充分。
b. 存在細(xì)胞二聚體。細(xì)胞二聚體將顯示為圖上大約兩倍熒光強(qiáng)度的第二個(gè)細(xì)胞群體。您應(yīng)該在染色之前和在流式細(xì)胞儀上運(yùn)行之前使用移液管輕輕混合細(xì)胞。
Q: 我應(yīng)該如何儲(chǔ)存和分裝抗體？
抗體在室溫下只穩(wěn)定幾天。請(qǐng)?jiān)谑盏胶髮⒖贵w分裝并儲(chǔ)存在-20℃。請(qǐng)避免反復(fù)凍結(jié)和解凍，您可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)中使用的量來(lái)分裝抗體，但每個(gè)分裝物的量不應(yīng)少于10 μL。每個(gè)分裝物的量越小，液體蒸發(fā)和容器吸附對(duì)抗體濃度的影響就越大。
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