蛋白常見問題及解答

Q: 什么是蛋白表達(dá)和純化？

蛋白表達(dá)是一種生物技術(shù)過程，用于產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)。它可以在原核生物、真核生物或體外大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進行。蛋白純化是一系列旨在從細(xì)胞或生物體中分離出一個或幾個蛋白質(zhì)的過程。蛋白質(zhì)純化的最常用方法是親和層析，它通過不同的蛋白質(zhì)標(biāo)簽進行設(shè)計。其他蛋白質(zhì)純化方法包括離子交換層析、分子排阻層析、拋光純化和疏水相互作用層析，可用于處理高純度的無標(biāo)簽蛋白質(zhì)。

Q: 蛋白質(zhì)是如何純化的？純度是否有保證？

根據(jù)融合蛋白的標(biāo)簽類型和蛋白質(zhì)本身的理化特性設(shè)計最佳純化方案。常用的純化方法包括：親和層析、疏水層析、離子交換層析、分子篩、鹽析等。我們保證的最低純度標(biāo)準(zhǔn)為〉85%。如果初始純化未達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)或客戶有更高的純度要求，我們還擁有AKATA純化儀器，該儀器高度自動化、精確控制，結(jié)合使用各種柱子，確保我們的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的純度進一步提高，并在COA報告上顯示最終純度測試結(jié)果。

雖然我們保證的最低純度標(biāo)準(zhǔn)為>85%，但我們制備的一些蛋白質(zhì)的純度達(dá)到了95%甚至97%。

Q: 為什么沒有或蛋白表達(dá)量很低？

可能存在的原因有：

a. 向量構(gòu)建錯誤。您應(yīng)該通過測序確認(rèn)向量或申請CUSABIO定制克隆服務(wù)。

b. 稀有密碼子。你應(yīng)該優(yōu)化密碼子，使用補充稀有密碼子的菌株，在較低的溫度下誘導(dǎo)或在較差的培養(yǎng)基中生長

c. 蛋白質(zhì)毒性。您應(yīng)該使用調(diào)控更嚴(yán)格的啟動子或較低的質(zhì)?？截悢?shù)。在基于T7系統(tǒng)的菌株中使用pLysS/pLysE菌株，或者選擇更適合表達(dá)毒性蛋白質(zhì)的菌株。在高OD值下開始誘導(dǎo)并縮短誘導(dǎo)時間。在使用含有Lac啟動子的表達(dá)載體時添加葡萄糖。

Q: 如何表達(dá)具有生物活性的蛋白質(zhì)？為什么蛋白質(zhì)無活性？

為了獲得具有生物活性的蛋白質(zhì)，您應(yīng)選擇正確的表達(dá)系統(tǒng)、適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)載體、合適的純化方法以及驗證實驗。此外，您還可以檢查以下問題：

a. 蛋白質(zhì)的溶解度較低。您可以將所需的蛋白質(zhì)與融合伴侶融合，并降低溫度。

b. 缺乏必要的翻譯后修飾。您應(yīng)選擇另一個表達(dá)系統(tǒng)。

c. 折疊不完整。您應(yīng)使用融合伴侶，并使用具有冷適應(yīng)分子伴侶的菌株。在較低溫度下與分子伴侶共同表達(dá)。監(jiān)測二硫鍵的形成，并允許進一步的體外折疊。

d. cDNA中的突變。您應(yīng)在誘導(dǎo)前后測序質(zhì)粒，或使用recA－菌株確保質(zhì)粒的穩(wěn)定性。在每次表達(dá)循環(huán)前轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

Q: 如何避免包涵體的形成并改善可溶性表達(dá)？

a. 高親水性或跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。您應(yīng)該添加融合標(biāo)簽或加入熱休克分子伴侶。在低溫下較短時間誘導(dǎo)表達(dá)，或者轉(zhuǎn)換至貧負(fù)載培養(yǎng)基。產(chǎn)生截短形式的蛋白質(zhì)或使用富含膜的菌株。

b. 錯誤的二硫鍵形成。您應(yīng)該添加融合伴侶蛋白，包括巰基還原酶、DsbA和DsbC?？寺〉胶蟹置谛盘栯牡馁|(zhì)粒中，使其分泌到細(xì)胞外腔。使用具有氧化型胞質(zhì)環(huán)境的gamiB (DE3）菌株。降低誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度。

c. 錯誤的折疊。您應(yīng)該使用融合伴侶蛋白。與分子伴侶一同共表達(dá)。使用具有冷適應(yīng)分子伴侶的菌株。向培養(yǎng)基中添加化學(xué)分子伴侶和輔因子。降低誘導(dǎo)劑濃度并添加新鮮培養(yǎng)基。在低溫下較短時間誘導(dǎo)表達(dá)。

Q: 為什么蛋白質(zhì)的分子量小于預(yù)測值？

可能存在的原因有：

a. 蛋白質(zhì)序列中包含罕見的氨基酸硒蛋白質(zhì)（Sec）或吡咯賴氨酸（Pyl）。您應(yīng)該使用其他氨基酸來代替這兩種不常見的氨基酸。

b. 融合蛋白質(zhì)的翻譯過程不平衡。您應(yīng)該更換其他的融合標(biāo)簽或?qū)⑷诤蠘?biāo)簽移到C端。在低溫下較短時間誘導(dǎo)表達(dá)，或者轉(zhuǎn)換至貧負(fù)載培養(yǎng)基。

c. 蛋白質(zhì)降解。您應(yīng)該替換特定的蛋白酶位點。使用蛋白酶缺陷菌株。在高光密度下誘導(dǎo)表達(dá)。在低溫下較短時間誘導(dǎo)表達(dá)，或者在破碎細(xì)胞時使用蛋白酶抑制劑。

Q: 為什么實際的帶狀大小與預(yù)測值不同？

可能存在的原因有：

a. 翻譯后修飾。如磷酸化、糖基化等會增加蛋白質(zhì)的大小。

b. 翻譯后剪切。許多蛋白質(zhì)首先合成為前蛋白質(zhì)，然后通過剪切產(chǎn)生活性形式。

c. 剪接變體。剪接變異可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。

d. 相對電荷。氨基酸的組成具有不同的相對電荷，這會影響電泳遷移性。

e. 多聚體，例如蛋白質(zhì)的二聚化。通常在還原條件下會被阻止，盡管強烈的相互作用可能會導(dǎo)致出現(xiàn)較高的帶狀。

f. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如二硫鍵、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)形成。

g. 疏水性蛋白質(zhì)，如跨膜蛋白質(zhì)，可能難以遷移到凝膠中，從而導(dǎo)致不同的多帶圖案。

Q: 如何重溶和儲存產(chǎn)品？

在打開蓋子之前，請先離心試劑管。

對于短期儲存或使用，請使用無菌去離子水將蛋白質(zhì)完全重溶至0.1-1.0 mg/mL。如有需要，重溶后經(jīng)過10—15分鐘后進行分裝，并儲存在4℃。

對于長期儲存，建議將細(xì)胞因子或重組蛋白添加5%-50%的甘油（最終濃度），并進行分裝以長期儲存在-20℃/-80℃。我們默認(rèn)的甘油最終濃度為50%?？蛻艨梢詤⒖即藵舛取?/p>

Q: CUSABIO使用哪些類型的標(biāo)簽進行融合？

CUSABIO提供的常見標(biāo)簽包括His-tag、FLAG-tag、GST-tag、MBP-tag、組合標(biāo)簽（His-GST-tag、His-sumo-tag、His-MBP-tag）等。有時，在制造過程中會確定蛋白質(zhì)的標(biāo)簽類型。如果您有指定的標(biāo)簽類型，請隨時與我們咨詢。

Q: 給定的標(biāo)簽類型會對蛋白質(zhì)的生物活性產(chǎn)生什么影響？

從理論上講，小的標(biāo)簽對蛋白質(zhì)活性影響很小。然而，具體對蛋白質(zhì)活性的影響無法一概而論（有些蛋白質(zhì)沒有影響，有些蛋白質(zhì)有輕微影響，而有些蛋白質(zhì)可能有較大影響）。

Q: CUSABIO能去除內(nèi)毒素嗎？

并非所有的內(nèi)毒素都可以去除。如果您需要去除內(nèi)毒素，請?zhí)崆芭c我們溝通，該過程需要2～3個工作日。我們可以提供免費的內(nèi)毒素去除服務(wù)，使用PMB親和層析法，并使用LAL試劑進行半定量檢測，確保內(nèi)毒素水平在0.1 ng/μg（1 EU/μg）以內(nèi)。

Q: CUSABIO能提供無菌生產(chǎn)加工嗎？

是的，我們可以提供這項服務(wù)，而且是免費的，但您需要在下訂單時備注此信息。我們在凍干之前對液體蛋白進行了無菌處理，但在凍干過程中可能存在污染，因此無法保證整個過程是無菌的。

Q: 如何確定細(xì)胞因子的物種交叉反應(yīng)性？

a. 除了少數(shù)例外情況外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子在小鼠細(xì)胞上具有活性。

b. 許多小鼠細(xì)胞因子也可能對人類細(xì)胞產(chǎn)生影響，但其活性可能低于相應(yīng)的人類細(xì)胞因子。

c. 少數(shù)人類細(xì)胞因子在作用于小鼠細(xì)胞時會比相應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子更活躍，例如IL-7。

d. 干擾素、GM-CSF、IL-3和IL-4等細(xì)胞因子是物種特異性的，幾乎對非同源細(xì)胞沒有活性。

e. 相比之下，成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）和神經(jīng)營養(yǎng)因子在不同物種的細(xì)胞上都具有良好的活性，它們高度保守。

Q: 通常使用的防腐劑是什么？通常添加哪種防腐劑？

常用的防腐劑包括Proclin 300、偶氮甲烷等。我們的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不添加任何防腐劑。

Q: 蛋白為什么要凍干？凍干對蛋白的影響有哪些？

蛋白質(zhì)對熱敏感，凍干能使絕大部分蛋白質(zhì)的活性保留下來，提高蛋白的穩(wěn)定性并延長保存時間，同時降低運費。

凍干有可能會造成蛋白的活性部分損失，聚集和其它變性問題。但可以通過添加保護劑（穩(wěn)定劑，添加劑，輔料）和控制凍干的各種條件來盡可能降低這些負(fù)面的影響。

溫馨提示：武漢華美提供的蛋白產(chǎn)品一般為凍干粉，它們在室溫條件下非常穩(wěn)定(至少1個月)。盡管如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃ ，以確保蛋白100%的活性。

Q: 凍干前為什么向蛋白溶液中加保護劑？一般凍干保護劑有哪幾種？你們的產(chǎn)品通常加的保護劑是什么？

保護劑是用來在凍干和儲存過程中保護蛋白的。常用的保護劑或穩(wěn)定劑有糖類，多元醇，聚合物，表面活性劑，某些蛋白和氨基酸等。我們通常加8%（質(zhì)量比體積）的海藻糖和甘露醇作為凍干保護劑。海藻糖可明顯阻止蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變以及凍干過程中蛋白質(zhì)的伸展和聚集；甘露醇也是一種普遍應(yīng)用的凍干保護劑和填充劑，可以降低某些蛋白的凍干后聚集情況。

溫馨提示：對于大多數(shù)蛋白，重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長期保存，請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后分裝凍存于-20℃或-80℃。一定要避免反復(fù)凍融，因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。

Q: 為什么我的管內(nèi)幾乎看不見蛋白產(chǎn)品？

CUSABIO的蛋白產(chǎn)品中不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等，并以最低含鹽量的溶液進行凍干時，常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。

溫馨提示：在打開管蓋前，我們建議您在小離心機中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準(zhǔn)確無誤，雖然有時您無法看到蛋白粉末，但管中的蛋白含量仍是非常精確的。

Q: 應(yīng)如何確定細(xì)胞因子的種屬交叉活性？

1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子對小鼠細(xì)胞均有活性。2) 許多小鼠細(xì)胞因子也可作用于人類細(xì)胞，但比活性可能低于對應(yīng)的人類細(xì)胞因子。 3) IL-7等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時比對應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細(xì)胞因子種屬特異，對非同源細(xì)胞幾乎沒有活性。5) 相反，成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動物種屬細(xì)胞上均具有很好的活性。

Q: 應(yīng)如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品？

第1步：開蓋前離心試劑管。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。一般需要3000-3500rpm離心5min，效果良好。

第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。這個步驟即為溶解步驟，非常重要。

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強度。產(chǎn)品說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時候會造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。

2) 一定要溶解到指定的濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，一般為0.1-1.0 mg/ml。但這一濃度范圍對于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃度范圍時細(xì)胞因子或蛋白會不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。

3) 一定不能振蕩(vortex)。這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。請用放至室溫的緩沖液作為溶劑。加緩沖液后，蓋好瓶塞，輕輕用手翻轉(zhuǎn)瓶子或把瓶子放在一個緩慢搖擺的搖床上。這樣做來保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個內(nèi)壁。 讓瓶子在室溫放置至少10 - 15分鐘，然后可以進行分裝或使用。

第3步：該重懸液在2-8℃最長可保存1周。

用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性最長可保持1周。這對一個周期為5-7天的實驗，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。

其實，說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在4℃保存，待1周內(nèi)用完。如進行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

第4步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。

如果一個實驗周期長于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細(xì)胞因子或重組蛋白進行長期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。

在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。

即在做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實驗時，細(xì)胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動物或人的蛋白，要想長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。