EphA3--細(xì)胞粘附和遷移的調(diào)節(jié)器
日期：2019-09-16 16:18:52
受體酪氨酸激酶（RTKs）是一類Ｉ型跨膜糖蛋白，它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移的功能。Eph受體家族(erythropoietin- producing human hepatocellular carcinoma)是目前為止最大的RTKs家族，該蛋白在結(jié)構(gòu)上高度保守，成員眾多[1]。EphA3(以前稱為HEK)是Eph受體家族的一員，它的異常改變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2][3]，可能會(huì)造成細(xì)胞形態(tài)特征和生物學(xué)特性的變化，如細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活率、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移及抗凋亡能力的改變。
1. Eph受體的發(fā)現(xiàn)
1987年，Hirai等克隆得到了Eph基因家族的第一個(gè)成員EphA1[4]，目前為止，在人類中，Eph基因家族已發(fā)現(xiàn)有14個(gè)成員[5]，在正常組織及腫瘤細(xì)胞中均有廣泛地分布。EphA3受體最初是從前B淋巴白血病細(xì)胞表面(ALL)細(xì)胞系(LK63)中分離得到的表面抗原[6]。
2. Eph受體
根據(jù)Eph受體家族的同源性、表達(dá)、分布及與配體的結(jié)合特性的不同而將其分成A和B兩個(gè)亞類：即EphA (EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10)、EphB (EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)受體。
2.1 Eph受體結(jié)構(gòu)
EphA3基因位于3號(hào)染色體3p11.2區(qū)域，該區(qū)域在多種不同的腫瘤組織中都存在著突變。
Eph受體包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞外配體結(jié)合區(qū)、細(xì)胞內(nèi)具酪氨酸激酶活性的功能區(qū)和連接這兩個(gè)區(qū)域的由疏水氨基酸組成的跨膜區(qū)。
細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括1個(gè)N端球狀結(jié)構(gòu)域(Glb)，一個(gè)由Sushi結(jié)構(gòu)域和EGF樣結(jié)構(gòu)域一起構(gòu)成富含半胱氨酸的連接區(qū)和兩個(gè)纖粘連蛋白Ⅲ型重復(fù)區(qū)。其中，球狀結(jié)構(gòu)域是與配體結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，決定了受體與配體的結(jié)合特性，該結(jié)構(gòu)域的突變可破壞抗EphA3單克隆抗體結(jié)合受體的能力。
胞內(nèi)區(qū)包括具酪氨酸激酶活性的結(jié)構(gòu)域、SAM結(jié)構(gòu)域（Sterile α-motif domain）和PDZ結(jié)構(gòu)域[7]。其中具有酪氨酸激酶活性的結(jié)構(gòu)域包含近膜區(qū)域（兩個(gè)參與Eph激酶活化的酪氨酸殘基位于該區(qū)域上）和與之緊鄰的激酶區(qū)域。激酶結(jié)構(gòu)域的激活環(huán)內(nèi)有激酶活化所需的第三個(gè)酪氨酸殘基。
SAM結(jié)構(gòu)域在Eph蛋白家族中高度保守，SAM結(jié)構(gòu)中的酪氨酸殘基是使受體信號(hào)分子聚集的必需位點(diǎn)[8]。SAM結(jié)構(gòu)域去除降低了EphA3突變體形成二聚體的能力，其磷酸化水平和激酶活性均受到影響[9]。
圖1. Eph受體的結(jié)構(gòu)
3. EphA3配體
EphA3的配體是：Ephrin-B2和Ephrin-A5。Ephrin配體依據(jù)與細(xì)胞膜附著方式的不同分為Ephrin-A和Ephrin-B兩個(gè)亞型。通過(guò)糖基磷脂酰肌醇鏈錨定在細(xì)胞膜上的稱為Ephrin-A亞型，共5種，Ephrin-B類配體共3種，屬于單次跨膜蛋白，由細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、跨膜部分和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組成。
Eph家族配體只有膜附著形式具有活性，可溶形式不僅無(wú)活性實(shí)際還起拮抗劑作用。
圖2. Eph家族配體的類型和結(jié)構(gòu)
4. EphA3表達(dá)
EphA3在大腦和脊髓，肺，腎，心臟和肌肉組織的胚胎發(fā)育的各個(gè)階段高度表達(dá)[10]。在正常成人組織中EphA3幾乎不存在，并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中稀疏表達(dá)[11]，在視網(wǎng)膜中表達(dá)相對(duì)較高，在膀胱，前列腺，子宮和心臟中的表達(dá)較少[12]。
EphA3在胃癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、肉瘤、膽管癌[13]、前列腺癌[14]等實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]。此外，EphA3在一些造血系統(tǒng)腫瘤和淋巴細(xì)胞腫瘤中存在著過(guò)度表達(dá)[16]。
5. EphA3功能
Eph-ephrin介導(dǎo)的細(xì)胞通訊控制著細(xì)胞的生物學(xué)功能，如細(xì)胞的附著和脫離、細(xì)胞的形狀和運(yùn)動(dòng)。
EphA3受體活性控制細(xì)胞-細(xì)胞粘附和收縮反應(yīng)。細(xì)胞-細(xì)胞黏附/脫黏附的調(diào)節(jié)主要通過(guò)蛋白水解酶進(jìn)行調(diào)控。蛋白水解破壞EphA3依賴的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。其中，跨膜金屬蛋白酶ADAM10是細(xì)胞與細(xì)胞接觸時(shí)調(diào)控信號(hào)傳遞的主要蛋白酶之一，它對(duì)EphA/ephrin-A細(xì)胞間相互作用的破壞至關(guān)重要。ADAM10富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)底物結(jié)合口袋，該口袋專門識(shí)別EphA3/ephrin-A5復(fù)合物，定位蛋白酶結(jié)構(gòu)域，將ephrin從相鄰細(xì)胞膜上分離。
酪氨酸激酶Eph受體及配體在正常細(xì)胞黏附、遷移、血管生成中發(fā)揮重要的作用，研究表明Eph受體或ephrin蛋白在維持血管、腎臟及腸道等組織的結(jié)構(gòu)上發(fā)揮著一定的作用[17]。此外，它們還和許多腫瘤血管的形成密切相關(guān)，并被認(rèn)為參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
5.1 EphA3在發(fā)育中的作用
Eph-ephrin通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞粘附和去粘附來(lái)控制正常和致癌發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞定位，從而影響細(xì)胞發(fā)育。Eph/ephrin信號(hào)在多個(gè)發(fā)育過(guò)程中被使用，從原腸胚形成和體細(xì)胞生成，到血管和神經(jīng)系統(tǒng)的模式。
Ephs對(duì)胚胎學(xué)過(guò)程至關(guān)重要，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。例如EphA3在視網(wǎng)膜頂蓋發(fā)育（retinotectal development）[18]中發(fā)揮著重要的作用，這與EphA3在人類視網(wǎng)膜中的高表達(dá)保持一致。
5.2 EphA3與癌癥
EphA3在多種腫瘤中表達(dá)，它與腫瘤干細(xì)胞和血管生成有關(guān)。
5.2.1 EphA3與實(shí)體瘤
EphA3在癌癥中廣泛突變，在實(shí)體腫瘤[19]中發(fā)現(xiàn)多達(dá)40個(gè)突變。許多突變影響Ephrin結(jié)合域、sushi-like和EGF-like結(jié)構(gòu)域(都參與配體結(jié)合)或激酶結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域的突變可能會(huì)導(dǎo)致正向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常。
在黑素瘤發(fā)現(xiàn)高EphA3水平。黑色素瘤細(xì)胞上的EphA3激活誘導(dǎo)Rho依賴性細(xì)胞骨架再組織和細(xì)胞回縮，這可能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。
Eph過(guò)表達(dá)還廣泛存在于間質(zhì)腫瘤中，包括肉瘤。
骨肉瘤和胃腸道間質(zhì)瘤以及GBM和其他神經(jīng)腫瘤中EphA3的表達(dá)升高。在一種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的間葉細(xì)胞亞型中也發(fā)現(xiàn)了EphA3的高表達(dá)，在這種間葉細(xì)胞亞型中，EphA3的表達(dá)與干細(xì)胞的維持密切相關(guān)。
EphA3在上皮性腫瘤也存在過(guò)表達(dá)，包括肺和腎的腫瘤。EphA3在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌的亞群中均有高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，EphA3在肺癌中的突變率達(dá)到了5%-10%，在多組肺癌組織中該基因缺失[20]。過(guò)量表達(dá)EphA3可以增加小細(xì)胞肺癌中腫瘤細(xì)胞凋亡率和G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，從而降低對(duì)化療藥物的抵抗[21]。EphA3在肝癌中的表達(dá)分布及其作用方面的研究更是只有少數(shù)幾例[22]。研究表明，EphA3在肝癌中的表達(dá)高低與肝癌的腫瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移、分級(jí)及存活率密切相關(guān)。EphA3在胃癌組織內(nèi)高表達(dá)也已被證實(shí)，高水平的EphA3表達(dá)與胃癌的血管生成和預(yù)后不良有關(guān)。
然而，與其他Ephs一樣，關(guān)于EphA3在癌癥進(jìn)展中的作用和表達(dá)并不總是一致的。
5.2.2 EphA3與血液惡性腫瘤
EphA3在血液惡性腫瘤中也存在異常表達(dá)。與表達(dá)EphA3的實(shí)體腫瘤相比，EphA3在血液病惡性腫瘤中的結(jié)構(gòu)正常。
研究表明EphA3在骨髓增生性腫瘤中的表達(dá)升高，而健康對(duì)照組的骨髓和外周血細(xì)胞中沒有EphA3。在不同時(shí)期，其表達(dá)水平存在差異，慢性髓系白血病(CML)患者在慢性期EphA3表達(dá)較低，在加速期或變胚期表達(dá)明顯升高。
此外，Eph RTKs還參與了許多與惡性腫瘤相關(guān)的其他過(guò)程，包括腫瘤微環(huán)境的改變，這可能促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生和血管生成。
6. Eph/Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)
Eph/Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)通道的概述如下：配體與Eph受體的胞外區(qū)域結(jié)合后使受體構(gòu)象發(fā)生變化，引起受體在胞膜上遷移、聚集，并形成寡聚化的受體配體復(fù)合物，激活胞漿的酪氨酸激酶而活化，導(dǎo)致自身磷酸化及下游大量胞內(nèi)底物蛋白質(zhì)分子的酪氨酸磷酸化，啟動(dòng)不同信號(hào)途徑將信號(hào)逐級(jí)傳遞。
Eph-ephrin相互作用的一個(gè)顯著特征是雙向信號(hào)傳導(dǎo)的現(xiàn)象，即Eph/Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)通道的特點(diǎn)是不僅作用于表達(dá)Eph細(xì)胞(正向信號(hào))，而且作用于表達(dá)Ephrin細(xì)胞(逆向信號(hào))，且正反向信號(hào)均可通過(guò)酪氨酸磷酸化依賴或非依賴傳導(dǎo)途徑進(jìn)行傳導(dǎo)。
圖3. Eph/Ephrin信號(hào)的雙向傳導(dǎo)
形成信號(hào)簇(最小四聚體)而不是受體二聚，是Eph-ephrin信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵要求。ephrin配體的聚類（Clustering）對(duì)于Eph信號(hào)傳遞是必要的，膜結(jié)合或成簇的ephrin刺激Eph活性，而可溶性的ephrins抑制Eph活性。例如，單體ephrin-A5可拮抗EphA3的活化[23]。
Ephrin結(jié)合導(dǎo)致三個(gè)主要酪氨酸的磷酸化-近膜區(qū)域中的Y596和Y602以及激酶活化環(huán)中的Y779，隨后激酶結(jié)構(gòu)域激活。CrkII適配蛋白被招募到活化的激酶域，對(duì)隨后的信號(hào)級(jí)聯(lián)至關(guān)重要，從而導(dǎo)致RhoA GTPases的活化。
Eph RTKs通過(guò)調(diào)節(jié)Rho或Ras家族GTP酶的活化狀態(tài)來(lái)靶向細(xì)胞骨架以改變細(xì)胞粘附/排斥和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性質(zhì)[24]。
Rho家族GTPases作為Eph受體的下游信號(hào)分子，它的激活使Rho家族內(nèi)的平衡轉(zhuǎn)移到優(yōu)先激活RhoA，抑制Rac1和Cdc42。Rac1/cdc42促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)遷移細(xì)胞中板足和絲狀足的形成，而RhoA抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。這使得細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性改變。
Eph除了可介導(dǎo)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化，還可以基于Eph RTK磷酸化狀態(tài)促進(jìn)或抑制存活途徑。
7. EphA3靶向治療
Eph受體酪氨酸激酶在正常和致癌發(fā)育過(guò)程中控制細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，并涉及一系列過(guò)程，包括血管生成，干細(xì)胞維持和轉(zhuǎn)移。Eph基因在腫瘤進(jìn)展的各種機(jī)制中發(fā)揮作用，因此，它們可作為癌癥治療的靶點(diǎn)。
鑒于EphA3和其他Ephs在腫瘤中所起的作用，包括激酶抑制劑的使用在內(nèi)的Eph抑制劑的開發(fā)已經(jīng)投入了大量的努力。
針對(duì)EphA3，Vearing等[25]嘗試?yán)每扇苄訣phA3的高黏附性配體EphrinA5來(lái)封閉EphA3，從而達(dá)到抑制其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能。
對(duì)于EphA3，最主要的治療候選藥物是單克隆抗體IIIA4。IIIA4，是靶向EphA3的IgG1κ單克隆抗體[6]。IIIA4的靶點(diǎn)位于與配體結(jié)合位點(diǎn)相鄰的EphA3胞外結(jié)構(gòu)域N端，對(duì)EphA3具有較高的親和力。與配體相似，預(yù)聚類的IIIA4能有效地觸發(fā)EphA3活化，細(xì)胞骨架收縮和細(xì)胞變圓，而非聚集的IIIA4也在體外加強(qiáng)配體激活。
利用抗體人工工程技術(shù)對(duì)IIIA4進(jìn)行了改造，制備出KB004，目前已進(jìn)入臨床開發(fā)階段。KB004可能會(huì)改變微環(huán)境，使其不利于腫瘤生長(zhǎng)和增殖。KB004對(duì)EphA3保持高親和力，具有強(qiáng)大的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。KB004目前正在血液病惡性腫瘤患者的I/II期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估(ClinicalTrials.gov標(biāo)識(shí)符：NCT01211691)。
圖4. IIIA4 / KB004在EphA3靶向治療中的作用
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華美 CUSABIO EphA3 蛋白
Recombinant Human Ephrin type-A receptor 3 (EPHA3), partial (Active) Code: CSB-MP007723HU
(Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.
Immobilized EPHA3 at 2 μg/ml can bind human EFNA5(CSB-MP007464HU). The EC50 of the protein is 0.9734-1.179 ng/ml.
Human EPHA3 protein his tag (CSB-MP007723HU) captured on COOH chip can bind Human EFNA5 protein Fc tag (CSB-MP007464HU) with an affinity constant of 13.8 nM
The purity of Human EPHA3 was greater than 95% as determined by SEC-HPLC.
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