納米抗體，強大的新型抗體!

1. 納米抗體的發(fā)現(xiàn)

納米抗體（Nbs）以其小分子量和獨特的分子結(jié)構(gòu)而特點明顯。這些特點使得它們在疾病診斷和治療等許多領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。

納米抗體是在20世紀80年代被發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)時，兩名大學(xué)生向比利時布魯塞爾自由大學(xué)的免疫學(xué)教授Hamers抱怨實驗課程的結(jié)果已經(jīng)被知曉，不具有挑戰(zhàn)性。于是，Hamers教授將冰箱中剩余的半升睡眠病駱駝血液交給了Muyldermans等人，告訴他們嘗試從中提純出駱駝抗體。Muyldermans等人驚訝地發(fā)現(xiàn)，從駱駝血液中提純出的某些抗體并不屬于所有脊椎動物的標準類型，而是一種全新的、更簡單的變異抗體。這一結(jié)果讓每個人都感到困惑。Hamers教授隨即組建了一個研究團隊，對這種抗體進行了專門的研究。從那時起，駱駝抗體從一個學(xué)生的實驗迅速演變?yōu)镠amers教授及其同事研究的主要項目。在1993年，Hamers等人首次在《Nature》雜志上報告了駱駝和鯊魚中存在一種天然缺乏輕鏈的重鏈抗體（HcAb）^[1]。與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，駱駝抗體除了缺少輕鏈外，在重鏈變異區(qū)和鉸鏈區(qū)之間沒有CH1區(qū)，只有一個重鏈變異區(qū)（VHH）和兩個傳統(tǒng)的CH2和CH3區(qū)。這個VHH被稱為納米抗體。關(guān)于納米抗體的結(jié)構(gòu)，我們將在下一節(jié)介紹。

2. 納米抗體的定義

納米抗體（Nbs），也稱為VHH抗體，是一種來源于羊駝重鏈IgG抗體（HCAb）的單一變異區(qū)域抗體，位于重鏈上。Nbs通常被視為傳統(tǒng)抗體的一種替代品，并且在生產(chǎn)和使用方面存在顯著的差異，這些差異影響了它們的適用性。Nbs和傳統(tǒng)抗體之間的主要區(qū)別與它們的結(jié)構(gòu)和領(lǐng)域有關(guān)。如圖1所示，傳統(tǒng)抗體具有兩個變異區(qū)域，分別稱為VH和VL，它們相互提供穩(wěn)定性和結(jié)合特異性。Nbs具有VHH領(lǐng)域并且缺少VL領(lǐng)域，但仍然具有很高的穩(wěn)定性。缺少VL領(lǐng)域還意味著Nbs具有親水性的一側(cè)。

圖1. 抗體和抗體片段的結(jié)構(gòu)和示意圖

*圖片來源于發(fā)表在《肛門生物肛門化學(xué)》上的出版物 ^[2]

重鏈抗體的VHH片段與傳統(tǒng)抗體的VH特性不同，但獨立克隆和表達的VHH結(jié)構(gòu)具有與原始重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和與抗原的結(jié)合活性，目前已知可以結(jié)合目標抗原的最小單位^[3]。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，VHH晶體寬度為2.5納米，長度為4.8納米，其分子量僅約為15KDa。

3. 納米抗體的生產(chǎn)過程

納米抗體（Nbs）越來越受到歡迎，作為研究試劑，越來越多的論文在文獻中使用了Nbs。在2018年9月3日，EMA批準了賽諾菲公司的納米抗體藥物（Caplacizumab，又稱Cablivi），用于治療成人獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）。Cablivi成為首個特異性aTTP治療藥物，也是首個上市的納米抗體藥物。

隨著首個納米抗體藥物的批準，如何大規(guī)模生產(chǎn)穩(wěn)定的Nbs成為急需解決的問題。目前，免疫文庫是生產(chǎn)Nbs的最常見選擇。如圖2所示，可以通過使用免疫原進行主動免疫或使用未免疫的駝科動物（如駱駝、單峰駝、美洲駝或羊駝）采集含有淋巴細胞的血液來獲得遺傳信息。一旦特定序列被擴增并插入克隆載體，就可以通過噬菌體展示技術(shù)進行篩選過程，以分離出最合適的Nbs，或使用其他方法，如細胞表面展示、mRNA/cDNA展示或質(zhì)譜鑒定等方法^[4]。進行這種篩選的最常用策略是基于噬菌體展示選擇。

圖2. 使用噬菌體展示庫的納米抗體生產(chǎn)方案

*圖片來源于發(fā)表在《肛門生物肛門化學(xué)》上的出版物 ^[2]

4. 納米抗體的優(yōu)勢

納米抗體（Nbs）的獨特特性使其在許多方面相比傳統(tǒng)抗體具有顯著優(yōu)勢。它們將單克隆抗體的理想特性與小分子藥物的一些有益特性相結(jié)合。

Nbs在高溫條件下具有很強的穩(wěn)定性，能夠保持生物活性，便于運輸和儲存。此外，Nbs在強酸和強堿條件下也很穩(wěn)定，因此可以制備口服制劑，而傳統(tǒng)抗體在高溫、強酸和強堿條件下容易分解，需要低溫儲存^{[5] [6]}；

由于其結(jié)構(gòu)特點，Nbs可以深入到抗原的內(nèi)部^[7]，因此它們可以識別傳統(tǒng)抗體無法接觸到的抗原；

Nbs非常小，可以進入腫瘤組織內(nèi)部完全清除腫瘤，還可以通過血腦屏障進入腦組織^[8]。傳統(tǒng)抗體的分子量是Nbs的十倍，組織滲透性較差；

Nbs的結(jié)構(gòu)簡單，可以在大腸桿菌和酵母等較簡單的微生物系統(tǒng)中大規(guī)模生產(chǎn)，從而顯著降低研發(fā)和生產(chǎn)成本，并解決抗體制品的大規(guī)模制備問題。

然而，Nbs作為體外診斷試劑仍存在一些障礙。由于Nbs的分子量較小，它們的結(jié)構(gòu)在用于臨床診斷試劑的開發(fā)之前需要進行修飾。然而，常用的結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)會對Nbs的生物活性產(chǎn)生負面影響，從而嚴重限制了納米抗體產(chǎn)品的應(yīng)用。

5. 納米抗體的應(yīng)用

Nbs具有許多有趣的應(yīng)用，其中許多尚處于早期階段的開發(fā)。這些應(yīng)用包括基礎(chǔ)研究和臨床治療。這些應(yīng)用主要分為三個部分，涉及研究、診斷和治療。

5.1 在研究中的納米抗體應(yīng)用

? Nbs作為親和捕獲試劑：與較大的抗體格式相比，由于其小尺寸和單一域格式，Nbs具有更高的親和力結(jié)合表面和較低的非特異性背景結(jié)合。通過其單價的結(jié)合方式，它們可以在溫和條件下被洗脫，其高穩(wěn)定性允許重復(fù)使用^{[9] [10]}。

? Nbs作為晶體化引導(dǎo)蛋白：由于Nbs能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)鎖定在特定構(gòu)象中，穩(wěn)定柔性結(jié)構(gòu)域并將聚集表面屏蔽在溶劑中，因此Nbs在晶體化具有良好的表現(xiàn)^{[11] [12]}。它們已在許多蛋白質(zhì)晶體化研究中使用，并且這些相同的特性也被用來穩(wěn)定淀粉樣β前纖維和防止成熟淀粉樣纖維的形成。

? 細胞內(nèi)靶標成像和免疫調(diào)節(jié)：在細胞內(nèi)起作用的抗體被稱為“細胞內(nèi)抗體”。由于Nbs在還原性細胞內(nèi)環(huán)境中也能非常好地折疊成功能性實體，Nbs與融合的熒光蛋白一起在細胞內(nèi)表達，可以用于跟蹤其在活細胞中的抗原活性^[13]。它們還可以用于功能性地敲除細胞中的抗原，并融合信號肽以定位到特定的亞細胞區(qū)域。

5.2 在診斷中的納米抗體應(yīng)用

? Nbs作為新型生物傳感器中的探針：可以在醫(yī)學(xué)、環(huán)境和食品分析領(lǐng)域中用于生物傳感器。它們的特異性功能基序容易引入，其小尺寸允許高容量的結(jié)合表面，從而提高了靈敏度。

? 用于非侵入性體內(nèi)成像的Nbs：由于其小尺寸，Nbs可用作非侵入性分子成像的示蹤劑，用于研究疾病過程，可實現(xiàn)快速組織穿透和血液清除。

5.3 在治療中的納米抗體應(yīng)用

? Nbs在抗毒素治療中的應(yīng)用：目前正在使用多克隆免疫球蛋白片段制備抗毒素，其效力低且不穩(wěn)定。此外，它們還具有嚴重的不良影響。Nbs的小尺寸使它們可以在體內(nèi)擴散，并與小毒素的生物分布相匹配，當(dāng)納米抗體捕獲毒素后，復(fù)合物仍然足夠小，可以通過腎臟迅速排除。

? 抗感染的納米抗體：可以作為抗細菌、病毒和寄生蟲感染的藥物進行開發(fā)。針對呼吸道合胞病毒的Nbs的I期臨床試驗表明，Nbs可以抵抗感染。Nbs不具有傳統(tǒng)抗體的Fc區(qū)域，因此它們不會中和和消除病原體。然而，它們具有自身固有的中和作用。

? 基于免疫的治療中的Nbs：可以通過抑制配體-受體相互作用，如拮抗抗von Willebrand因子以阻止血栓形成的啟動，或抑制抗TNF-α以治療關(guān)節(jié)炎等方式，用于對抗癌癥和其他疾病。

6. 納米抗體在SARS-CoV-2治療中的最新進展

在本部分，我們收集了幾個關(guān)于納米抗體在SARS-CoV-2治療中的最新研究進展，如下所示：

? 2020年5月5日，Jason S. McLellan等人在《Cell》雜志上發(fā)表了題為“Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies”的研究。該研究發(fā)現(xiàn)，他們從用預(yù)穩(wěn)定的冠狀病毒棘蛋白免疫的駱駝體內(nèi)分離出了單域抗體（VHHs）。這些VHHs能夠中和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（MERS-CoV）或嚴重急性呼吸綜合癥冠狀病毒1（SARS-CoV-1）的S假型病毒。該研究還表明，針對SARS-CoV-1 S的VHH和SARS-CoV-2 S之間存在交叉反應(yīng)，并證明這種交叉反應(yīng)的VHH以雙價人類IgG Fc融合體的形式中和了SARS-CoV-2 S假型病毒。這些研究結(jié)果為通過VHH中和致病性冠狀病毒提供了分子基礎(chǔ)，并暗示這些分子在冠狀病毒爆發(fā)期間可能作為有用的治療藥物^[14]。

? 2020年5月14日，中國復(fù)旦大學(xué)的研究人員在《Cell Host & Microbe》雜志上在線發(fā)表了題為“Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2”的論文。研究人員成功建立了一個噬菌體展示的人類單域抗體文庫。這個多功能平臺可以迅速分離人類納米抗體（Nbs）并篩選SARS-CoV-2抗體。Nbs不僅可以單獨使用，還可以與其他抗體合作；小尺寸的特性也成為構(gòu)建雙特異性或多特異性抗體的理想模塊，有效防止病毒逃逸突變的出現(xiàn)以及許多其他優(yōu)勢。因此，這些全人源納米抗體有望成為臨床治療COVID-19的有效預(yù)防和治療藥物^[15]。

? 2020年6月6日，中國的一個科研團隊在《Cell》雜志上在線發(fā)表了題為“Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2”的研究。他們報告了一種規(guī)模試驗性生產(chǎn)的滅活SARS-CoV-2疫苗候選劑（BBIBP-CorV），該疫苗能夠在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物中誘導(dǎo)高水平的中和抗體效價，從而提供對SARS-CoV-2的保護。此外，BBIBP-CorV在疫苗制造方面具有高效的生產(chǎn)能力和良好的遺傳穩(wěn)定性。這些結(jié)果支持進一步在臨床試驗中評估BBIBP-CorV的價值^[16]。