DT3C-ADC抗體內(nèi)化效率體外檢測(cè)新工具
日期:2022-03-30 11:17:23
2014年MikiYamaguchi等人通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的一種重組蛋白,主要用于體外檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)mAb的內(nèi)化效率,進(jìn)而篩選出更有效的單克隆抗體。該蛋白包括一個(gè)沒有受體結(jié)合域的白喉毒素diphtheria toxin (DT)和鏈球菌蛋白G(Streptococcus protein G)的C1、C2、C3 (3C)結(jié)構(gòu)域,即DT3C。DT3C是繼Mab-ZAP之后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)化mAb效率的有效工具,文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示,與mAb-Mab-ZAP相比,mAb-DT3C模擬的抗體偶聯(lián)藥物( Antibody-Drug Conjugate,ADC)具有易制備、分子量穩(wěn)定及抗體內(nèi)化效率高等特點(diǎn)[1]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DT3C在ADC抗體藥內(nèi)化效率檢測(cè)中的作用,2015年,MikiYamaguchi等人又利用DT3C作為工具篩選了一種靶向胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的anti-Mucin 13單克隆抗體[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前DT3C作為檢測(cè)mAb內(nèi)化能力的工具已經(jīng)用于近130項(xiàng)ADC藥物mAb篩選專利中,那DT3C究竟是如何介導(dǎo)ADC藥物mAb內(nèi)化效率檢測(cè)的呢?
華美生物可提供高純度的DT3C蛋白,助力ADC藥物研發(fā)
1、什么是ADC藥物內(nèi)化?
在細(xì)說DT3C是如何介導(dǎo)ADC藥物mAb內(nèi)化效率檢測(cè)之前,我們先來了解下什么是ADC藥物mAb內(nèi)化。ADC藥物由抗體、連接子和小分子毒素組成,是通過連接子(linker)將具有生物活性的小分子藥物偶聯(lián)至單克隆抗體上。單抗通過腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的特異性和靶向性定位到腫瘤細(xì)胞表面,并通過內(nèi)吞/內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞,連接子在細(xì)胞內(nèi)低pH值或溶酶體蛋白作用下斷裂,釋放出具有活性的細(xì)胞毒藥物,破壞DNA或阻止腫瘤細(xì)胞分裂,從而對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用。該類藥物利用抗體的特異性靶向運(yùn)輸藥物分子到靶組織發(fā)揮作用,將細(xì)胞毒藥物強(qiáng)大的細(xì)胞殺傷能力集中于腫瘤細(xì)胞,降低對(duì)正常組織的毒副作用。在ADC設(shè)計(jì)研發(fā)過程中,首要的是藥物靶點(diǎn)的選擇。對(duì)于藥物靶點(diǎn)的選擇,除了要在腫瘤過度表達(dá)外,另一個(gè)重要因素是內(nèi)吞/內(nèi)化的效率,這是藥物釋放活性所必需的??贵w能否被內(nèi)化主要由靶點(diǎn)決定,而抗體內(nèi)化的效率則與抗原密度、抗體親和力以及抗體與抗原結(jié)合表位密切相關(guān)。同一靶點(diǎn)的不同抗體也會(huì)表現(xiàn)出不同的內(nèi)化效率。
2、DT3C如何介導(dǎo)ADC抗體藥物內(nèi)化效率體外檢測(cè)?
如前所述,ADC藥物中抗體能否被內(nèi)化是藥物效果評(píng)價(jià)的重要因素。這里你可能會(huì)疑問,ADC藥物中抗體的內(nèi)化與單純的抗體藥物內(nèi)化有區(qū)別嗎?為什么DT3C是專門針對(duì)的ADC藥物呢?首先,ADC藥物中抗體的內(nèi)化與單純的抗體藥物內(nèi)化肯定是有區(qū)別,首先ADC藥物的分子量是大于單純的抗體藥物的,相同條件下,二者的內(nèi)化效率肯定是不一樣的。其次,DT3C替代的是ADC藥物分子中的小分子藥物,是一種免疫毒素,mAb-DT3C偶聯(lián)物模擬的是ADC藥物。如下圖所示:mAb-DT3C偶聯(lián)復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面抗原后,mAb-DT3C-抗原復(fù)合物被內(nèi)化;然后DT3C被胞質(zhì)弗林蛋白酶(furin protease)切割,DT3C的催化結(jié)構(gòu)域被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。DT3C的催化結(jié)構(gòu)域?qū)е卵由煲蜃?EF)-2的 ADP-核糖基化,隨后通過抑制蛋白質(zhì)翻譯機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞毒性。
圖1. Mechanism of antibody:DT3C-induced cytotoxicity
作為ADC藥物抗體內(nèi)化檢測(cè)工具,DT3C優(yōu)勢(shì)可總結(jié)為以下三點(diǎn):
第一,mAb-DT3C偶聯(lián)物制備簡(jiǎn)單,僅在室溫下孵育30min就能形成,而且在體外可以發(fā)揮患者給ADC藥物后的功能;
第二,DT3C可與來自不同物種(如人、小鼠、兔、山羊)的任何 IgG 結(jié)合,形成 mAb-DT3C 偶聯(lián)物,從而進(jìn)一步擴(kuò)大了DT3C作為mAb抗體內(nèi)化檢測(cè)工具的范圍;
第三,只有當(dāng)偶聯(lián)物被靶細(xì)胞內(nèi)化時(shí),mAb-DT3C 偶聯(lián)物才會(huì)顯著降低細(xì)胞活力。
值得一提的是,在DT3C之前,Mab-ZAP是唯一能夠檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)化mAb 效率工具。 Mab-ZAP由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。當(dāng) mAb-Mab-ZAP 偶聯(lián)物被細(xì)胞內(nèi)化時(shí),由于皂草素的毒性,細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。所以可以通過細(xì)胞的存活率來檢測(cè)mAb是否被細(xì)胞內(nèi)化。但是,不能排除Mab-ZAP本身在一定程度上可能降低mAb內(nèi)化效率,因?yàn)?Mab-ZAP是一種包含抗小鼠抗體的大分子。與Mab-ZAP相比,mAb-DT3C偶聯(lián)物的分子量穩(wěn)定且小于mAb-Mab-ZAP。并且,相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,mAb-DT3C內(nèi)化效率高于mAb-Mab-ZAP。
3、ADC藥物內(nèi)化途徑
目前,關(guān)于mAb-DT3C復(fù)合物內(nèi)化的具體途徑暫無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。結(jié)合常規(guī)的ADC藥物內(nèi)化途徑,一般來說,內(nèi)化又稱為內(nèi)吞,正常的內(nèi)吞作用可分為三個(gè)階段:芽的形成、膜的彎曲和囊泡的成熟和膜的斷裂并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。ADC藥物內(nèi)化途徑可按是否依賴于網(wǎng)格蛋白分為:網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用又可進(jìn)一步分為:小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白/GPI-富集的早期內(nèi)區(qū)室(CLIC/GEEC)和巨胞飲作用。多種內(nèi)吞途徑有重疊的方面,因此內(nèi)吞的過程一般是高度靈活和復(fù)雜的。這里以小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用為例:
網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(CME)包括幾個(gè)連續(xù)和部分重疊的步驟。對(duì)于質(zhì)膜上的一些受體而言,CME可以組成型發(fā)生;其他受體則需要配體或抗體結(jié)合后啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開始聚集在質(zhì)膜的內(nèi)小葉上時(shí),CME就開始了。衣殼蛋白通過從細(xì)胞質(zhì)中招募并與額外的蛋白質(zhì)接頭并相互作用,繼續(xù)組裝和生長。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲,從而將內(nèi)化受體/配體集中到一個(gè)“網(wǎng)格蛋白包被坑”(CCP)中。在CCP頸部因CCP內(nèi)陷變大而收縮的點(diǎn)處會(huì)通過斷裂與質(zhì)膜分離。肌動(dòng)蛋白聚合有助于將CCP “向內(nèi)”拉入細(xì)胞質(zhì),直到完全分裂,CCP 被釋放并變成網(wǎng)格蛋白包被的囊泡 (CCV)。最后,CCV外殼解體,CCV與內(nèi)體融合,分揀到確定的亞細(xì)胞位置,或者可以循環(huán)回細(xì)胞表面 [3]。
參考文獻(xiàn):
[1] Yamaguchi M, Nishii Y, Nakamura K, et al. Development of a sensitive screening method for selecting monoclonal antibodies to be internalized by cells [J]. Biochem Biophys Res Commun. 2014: 454(4):600-3.
[2] Nishii Y, Yamaguchi M, Kimura Y, et al. A newly developed anti-Mucin 13 monoclonal antibody targets pancreatic ductal adenocarcinoma cells [J]. Int J Oncol. 2015, 46(4):1781-7.
[3] Hammood M, Craig AW, Leyton JV. Impact of Endocytosis Mechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-Drug Conjugates (ADCs)-A Necessity for Future ADC Research and Development [J]. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Jul 15;14(7):674.