免疫組化(IHC/ICC)方案
原理
免疫組化,是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特 異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離 子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對其進(jìn)行定位、定 性及相對定量的研究,稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。
抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性,免疫組織化學(xué)正是利用了 這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來,以此作為抗原或半 抗原,通過免疫動物后獲得特異性的抗體,再以此抗體去探測組織或細(xì)胞中 的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無色的,因此還必須借助于 組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來,以期達(dá)到對組織或細(xì)胞 中的未知抗原進(jìn)行定性,定位或定量的研究。
用途
對組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性,定位或定量。
步驟(以石蠟切片為例)
1. 脫蠟和水合
去除切片中的石蠟,暴露組織。進(jìn)一步,恢復(fù)組織的水環(huán)境,以幫助檢測。
(1) 用二甲苯或環(huán)保脫蠟劑浸泡切片至少60分鐘,使組織脫蠟。在這道工序 之前,最好先加熱切片融化石蠟,這樣對去除石蠟會更有效。
(2) 將染色架依次置于100%、100%、95%、85%、75%、60%梯度酒精中,分別浸泡5min。
(3) 0.3% TritonX-100用于滲透細(xì)胞膜,有助于分子進(jìn)入靶細(xì)胞,5分鐘即可。
注意事項:
a. 全程保持切片各部位呈濕潤狀態(tài),否則會有很高的背景。
b. 二甲苯有毒,可以用組織透明脫蠟劑代替。
c. 脫蠟前可對切片進(jìn)行加熱,以達(dá)到更好的脫蠟效果。
d. 通常使用2% APES- 丙酮緩沖液,通過將切片浸泡1min 并在60℃下加熱 15 min來防止切片上的組織剝離。
e. 脫蠟的時間因溫度和試劑的不同而有所不同。夏天,室溫比較高,可以適 當(dāng)縮短時間。此外,如果脫蠟劑已經(jīng)使用了一段時間,最好延長使用時間 或更換新的試劑。
2. 清除內(nèi)源性酶干擾和抗原修復(fù)
在固定過程中,甲醛可以與組織中的抗原交聯(lián),阻斷抗原決定因子。因此,有必要打開抗原與甲醛的交聯(lián)效應(yīng),以提高組織抗原的檢出率。有幾種方 法可以達(dá)到這一點,包括酶修復(fù)和熱修復(fù)。經(jīng)實驗驗證,熱修復(fù)效果優(yōu)于酶修復(fù)。此外,修復(fù)緩沖液也會影響抗原的恢復(fù)效果。有三種緩沖液的pH 值不同,包括檸檬酸緩沖液(pH 6.0),EDTA緩沖液(pH 8.0)和TE緩沖液(pH 9.0)。 一般pH值越高,修復(fù)力越強(qiáng)。內(nèi)源性酶,包括過氧化物酶和生物素,可與顯色底物DAB 和生物素標(biāo)記的二抗相互作用,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。所以我們需要去除內(nèi)源性酶。長期實驗證明,用ddH2O或 PBS 或TBS 或甲醇稀釋3%H2O2,在10分鐘之內(nèi)可以很好地消除內(nèi)源酶的影響。
(1) 用3%H2O2去除內(nèi)源酶干擾5min。
(2) 于pH 值7.4的PBS 中浸泡切片。
(3) 在1L燒杯中準(zhǔn)備500ml 檸檬酸鈉緩沖液,并放入高壓鍋中。將帶墊圈的 緩沖液在水浴中加熱至100℃。然后,將染色架放置在煮熟的緩沖液中。燒杯口用保鮮膜密封,防止水蒸氣在加熱過程中進(jìn)入緩沖液。用 1000w 的電源繼續(xù)加熱至高壓狀態(tài),保持2分鐘,然后立即停止加熱。
(4) 等到高壓鍋自然冷卻,開蓋取出燒杯,自然冷卻至室溫。
(5) PBS 分3次沖洗5分鐘。
3. 封閉
該過程是阻斷抗體與來自同一來源的二抗的血清的非特異性結(jié)合。用10%非免疫山羊血清阻塞組織,每片100μL,置于濕箱中室溫靜置30min。
4. 抗體解育
免疫組化實驗應(yīng)選擇經(jīng)驗證的一抗??贵w的稀釋比和孵育時間應(yīng)根據(jù)實際情況進(jìn)行優(yōu)化。建議低溫和較長的孵育時間,以確??贵w與抗原更好的結(jié)合。
(1) 除去封閉緩沖液。
(2) 將抗體稀釋至適當(dāng)濃度,加入組織中4℃解育過夜。我們推薦0.01μg/ml 作 為工作濃度。
(3) 用PBST 清洗切片3次,每次5 min。
(4) 按說明書稀釋二抗至工作濃度,37℃孵育1小時。我們選擇生物素標(biāo)記 抗體作為二抗。
(5) 用PBST 清洗切片3次,每次5 min。
(6) 第三個抗體按說明書稀釋至工作濃度,37℃孵育1h。
(7) 用PBST 清洗切片3次,每次5 min。
注意事項:
a. 為尋求最佳抗體孵育濃度,在正式實驗前應(yīng)通過設(shè)置梯度稀釋進(jìn)行初步實驗。
b. 建議抗體在低溫條件下孵育較長的時間,以確??贵w和抗原的充分結(jié)合。 c.切片必須輕柔地清洗干凈,特別是在孵育不同抗體時。
5. 染色
這個過程中用到不同的檢測系統(tǒng)。 一種被標(biāo)記的一抗直接與底物反應(yīng)稱為 一步染色法。但是很貴。此外,還可以通過標(biāo)記二抗對目標(biāo)蛋白進(jìn)行染色, 放大檢測信號,稱為兩步法。還有一種三步法,標(biāo)記第三個抗體以獲得更好 的檢測信號放大。標(biāo)記基團(tuán)可以是HRP 或AP。 該基團(tuán)可以通過與不同底物 反應(yīng)而著色。DAB 是一種常見的染色底物。以下,我們執(zhí)行三步法,其中二 抗用生物素標(biāo)記,第三個抗體偶聯(lián)HRP。 最后,用蘇木精染色細(xì)胞核。
(1) 用PBS 中清洗切片2次,每次5 min。
(2) 配制新鮮的DAB, 使用前過濾。
(3) 在組織中加入DAB, 立即在顯微鏡下觀察染色情況。
(4) 當(dāng)組織有明顯染色時,必須及時在PBS 中清洗切片。
(5) 用蘇木精染色液染色細(xì)胞核,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。
注意事項:
a. DAB 和蘇木精使用前應(yīng)過濾。
b. 使用前DAB 中應(yīng)加入新鮮的H2O。
c. 在顯微鏡下觀察標(biāo)記基團(tuán)與底物的反應(yīng),及時終止顯色時間,時間不超過10分鐘。
6. 檢測
(1) 將切片在60℃下加熱至干燥,然后加入適量中性香脂密封組織;
(2) 在顯微鏡下觀察染色,在合適的視野下拍照。
常見問題
1. 無染色
(1) 一抗和二抗不匹配,使用針對一抗的二抗(如一抗來自兔,二抗為抗兔 抗體)
(2) 沒有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合,使用低稀釋度抗體。延長4℃孵育時 間(如過夜)。
(3) 抗體的天然結(jié)構(gòu)受損,不適用于IHC, 用天然(非變性的)WB 法檢測抗 體,確??贵w沒被損壞。
(4) 由于儲存不當(dāng)、稀釋或反復(fù)凍融造成一抗/二抗試劑盒失效,做陽性對 照確認(rèn)一抗/二抗試劑盒的有效性。
(5) 靶組織中沒有目標(biāo)蛋白,參照抗體供應(yīng)商的建議做陽性對照。
(6) 組織中沒有足夠的目標(biāo)蛋白,應(yīng)用信號放大操作。
(7) 沒有避光保存二抗,避免將二抗處于光照下。
(8) 脫蠟不徹底,延長脫蠟時間,更換二甲苯。
(9) 固定步驟(使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑)修飾了抗體識別表位,抗 原修復(fù)法暴露出抗原表位,縮短固定時間。
(10) 蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)(核蛋白),抗體不能穿透核膜,在封閉液和抗體稀 釋液中加入通透劑。
(11) PBS 緩沖液被細(xì)菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根在抗體PBS 儲存液 中加入0.01%疊氮化合物,或使用新鮮無菌的PBS。
2. 高背景
(1) 沒有封閉非特異性結(jié)合或封閉不充分,延長封閉時間,并考慮更換封閉劑。
建議用10%正常血清封閉切片1小時或1-5% BSA 封閉培養(yǎng)細(xì)胞30 分鐘。
(2) 一抗?jié)舛冗^高
滴定法尋找到最佳抗體濃度,或在濃度較低抗體中延長孵育時間(最 好是緩慢而準(zhǔn)確地結(jié)合)。
(3) 孵育溫度過高,4℃孵育切片或細(xì)胞
(4) 二抗發(fā)生了非特異性結(jié)合(被損壞),不加一抗,做二抗對照。
(5) 組織沖洗不徹底,有固定劑殘留,所有步驟都要用PBS 充分洗滌。
(6) 存在內(nèi)源性過氧化物酶活性,用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM),或抑制過氧化物酶的H2O2 (0.3%v/v)。(詳見IH 操作手冊)。
(7) 固定過度(固定劑用福爾馬林和多聚甲醛)導(dǎo)致抗體識別抗原位點被 修飾,改變抗原修復(fù)方法,縮短與抗原修復(fù)液的孵育時間。
(8) 信號過度放大(信號放大技術(shù)),縮短信號放大孵育時間,稀釋信號擴(kuò) 大試劑盒。
(9) 底物過量(酶檢測法),縮短底物孵育時間
(10) 染料與PBS 在細(xì)胞/組織中相互作用(酶檢測法)
用Tris緩沖液沖洗切片后,再與底物孵育。孵育后,Tris緩沖液再次沖洗細(xì)胞/切片。
(11) 通透作用破壞膜并除去了膜蛋白,去除緩沖液中的通透劑。
3. 非特異性染色
(1) 一抗/二抗?jié)舛冗^高,降低抗體濃度和或縮短孵育周期。對比不表達(dá)目 標(biāo)蛋白細(xì)胞的信號強(qiáng)度。
(2) 存在內(nèi)源性過氧化物酶活性,用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM),或抑制過氧化物酶的H2O2 (0.3% v/v)。(詳見IHC操作手冊)。
(3) 一抗與被染組織同源(如用鼠一抗測鼠組織),加二抗后,二抗會與同源 的所有組織結(jié)合,應(yīng)用與組織非同源的一抗。
(4) 切片/細(xì)胞變干,保持切片/細(xì)胞濕度,切勿變干。